就像他们说的，
数学是火，点亮物理的灯；
物理是灯，照亮化学的路；
化学是路，通向生物的坑；
生物是坑，埋葬了理科生。
从678走来的我们，
都希望自己的人生从此'666',
然而现实却有一万种理由让你“555“。
虽然经常被人调侃
“生物专业不是文科吗？”
当年填报志愿时，
表哥那一句
'21世纪是生命科学的世纪'
仍回荡在耳旁，
”激励“着我前行。
作为专注蛋白表达的AtaGenix小编，
肯定要先扒一扒
那些SDS-PAGE的陈年往事。
毕竟，
敬业才是当前最重要的。
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先从PAGE说起。
PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis），聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化。 催化聚合的常用方法有化学聚合法和光聚合法，化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。PAGE有Native-PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）和 SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶）两种形式。Native-PAGE过程中蛋白质能保持完整状态，并依据分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE
仅根据蛋白质亚基分子量的不同
就可以分开蛋白质。
原因
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SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
当年的高考状元（如今的实验狗）对原理有更详细的阐述：
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比有较高的分辨率。先把较稀的样品加在浓缩胶（作用是堆积，凝胶浓度较小，孔径较大）上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸时，电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快， 甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
SDS-PAGE的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺-丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺-丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。用5-15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表（双丙烯酰胺-丙烯酰胺摩尔比为1：29）：
SDS-PAGE经常应用于蛋白提纯过程中纯度的检测。纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS-PAGE具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
但在做SDS-PAGE实验过程中
有可能问题层出不穷
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SDS-PAGE二十二问给你答案
聚丙烯酰胺
丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
制胶缓冲液
浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择Tris-HCl系统。
TEMED与AP
AP 催化单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合成聚丙烯酰胺。TEMED是催凝剂，可加速AP催化作用。
SDS
阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物， SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，可利用分子量的差异将各种蛋白质分开。
甘氨酸
它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
上样缓冲液
蛋白上样缓冲液(loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散到电泳缓冲液。
根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：
1
还原SDS处理
在上样buffer中加入SDS和DTT（或β-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中只根据分子量来分离。
注：一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5 min，再离心加样。
2
带有烷基化作用的还原SDS处理
碘乙酸胺的烷基化作用可以很好并经久牢固地保护SH基团，得到较窄的谱带。另外碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
3
非还原SDS处理
生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1% SDS沸水中煮3 min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致（多出现于较厚的凝胶中），可待其充分凝固再做后续实验。
常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的,当凝胶和玻璃板组成的'三明治'底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。可在加样前离心、选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂、重新配制时间过长的电泳缓冲液或者降低凝胶浓度。
主要是不溶性样品颗粒引起的，可在加样前离心或加适量样品促溶剂。
常常是由于滤纸条或电极放置不平行或加样位置偏斜而引起，检查位置是否正确并作出相应调整。
这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的，可减少加样量。
建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
在跑构象复杂的蛋白质分子时，“鬼带”常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀。主要是还原剂在加热过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。可在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta-巯基乙醇，以补充不足的还原剂或加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象,这主要与缓冲液和分离胶的浓度有关，可更换正确pH值的缓冲液或降低分离胶的浓度。
电泳中条带很粗是常见的事，主要是蛋白未浓缩好的原因。可适当增加浓缩胶的长度，保证浓缩胶贮液的pH正确（pH6.7）或适当降低电压。
这种现象一般初学者容易遇到。比如电压50 v以上，可电流却在5 mA以下。这主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路所致。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。将电泳槽正确装配即可。
一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致，后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧导致空气进入引起的。
通常胶在30 min-1 h内凝固。如果凝的太慢，可能是TEMED和APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用。TEMED不稳定，易被氧化成黄色，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶速度。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。
可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的PH选择错误，即缓冲系统的PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。
